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突触前成像技术研究进展
2008-10-17  
 

戴竞耀

 

【摘  要】 FM1-43荧光染色技术和绿荧光蛋白突触前成像技术是目前两种研究突触前膜的主要手段。FM1-43分子在水中不显示荧光,但当它们插入脂质膜后则显示出较强的荧光,用于研究突触前膜的“胞吐”过程。绿荧光蛋白成像技术避免了FM1-43荧光染色成像技术的局限性,其基本原理是通过基因转染方法将绿荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中,并使其选择性地在突触囊泡中表达产生荧光,可用于突触前膜“胞吐”和“胞饮”过程的研究。

【关键词】 FM1-43GFPgreen fluorescent protein 绿荧光蛋白);pHluorin    

 


突触是相互连接的两个神经元之间或神经元与效应器之间的接触部,由突触前膜、突出囊泡和突触后膜组成。突触前膜中,神经递质经“胞吐”作用从突出囊泡释放到突出间隙,又经“胞饮”作用回收突触囊泡,因此对突触前膜的研究已成为神经科学领域的研究热点。FM1-43荧光染色技术和绿荧光蛋白突触前成像技术是目前两种研究突触前膜的主要手段,本文将对其分别加以综述,并对近年来突触前成像技术相关研究成果加以介绍。

 

1 常用突触前成像技术

 

1.1 FM1-43荧光染色成像技术

1.1.1 FM1-43简介   

FM1-43荧光素记法于上世纪末由 美国Fei Mao分子研究公司和科罗拉多Bill Betz实验室首创。FM1-43荧光素是一种研究细胞膜分泌活动的选择性膜表面标记物,它由带两个正电荷的酸性分子组成。FM1-43分子在水中不显示荧光,但当它们插入脂质膜后则显示出较强的荧光[1]

1.1.2 FM1-43荧光素的成像机制  

FM1-43标记到突触囊泡脂质膜上。突触前膜的胞吐过程即突触囊泡膜与质膜融合将其内含物排放到突出间隙的过程,此时囊泡末与质膜融合处的开口呈“Ω”状通向突触间隙,原来被标记在突出囊泡膜上的FM1-43分子就会随着融合过程扩散到质膜上,当囊泡膜与质膜完全融合后,FM1-43就会从质膜上脱落扩散到突出间隙中去。从突触囊泡膜与质膜未融合前到融合时FM1-43扩散到质膜上这一过程,FM1-43始终未脱离脂质膜,既显示着荧光;当FM1-43从质膜脱离弥散到突出间隙时,荧光便会消失,这样便可以清晰地显示出突触前膜的胞吐过程。

值得注意的是,FM1-43从扩散到脱落这一过程耗时极短,为了便于研究,需要延长这一过程的时间。近年来采用一种蛋白“融合孔”的方法,即当囊泡末与质膜融合时,再“Ω”状开口处(即“融合孔”)加入一“蛋白圈”来限制囊泡膜与质膜融合这一过程,延长融合时间和FM1-43从在质膜上扩散到离去的时间[12]

1.1.3 FM1-43荧光染色成像技术的局限性    

突触传递是“胞吐”和“胞饮”的动态循环过程。FM1-43荧光素标记法虽然能够较为清晰地描述“胞吐”的过程,但却无法描述“胞吞”的过程。另外,FM1-43标记使“胞吐”过程显示荧光的同时也会使背景产生较强的荧光,这样会对观察“胞吐”过程造成一定干扰。

1.2 绿荧光蛋白突触前成像技术

1.2.1绿荧光蛋白成像技术简介

绿荧光蛋白成像技术避免了FM1-43荧光染色成像技术的局限性,在突触前膜研究中应用更加广泛。其基本原理是通过基因转染方法将绿荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中,并使其选择性地在突触囊泡中表达产生荧光,然后用激光扫描共聚焦显微镜来检测囊泡的运动过程。

1.2.2绿荧光蛋白的成像机制

GFP基因会在囊泡中表达一种GFP 的异变体蛋白pHluorin,这种蛋白与囊泡膜上的囊泡-质膜结合蛋白(VAMP)结合而使囊泡膜被标记。在碱性环境中pHluorin会因获得一个质子而产生较强的荧光。由于囊泡腔内是酸性环境,故pHluorin在囊泡腔内不显示荧光。当囊泡与质膜融合后,囊泡腔中的环境会由酸性变为碱性,此时pHluorin就会被碱性环境激活而产生荧光,这样便可以清晰的观察胞吐的过程。“胞饮”过程是囊泡的重酸化过程,此时囊泡膜上的pHluorin分子会因重新进入酸性环境而使荧光消失,pHluorin从产生荧光到荧光消失所耗的时间即时从“胞吐”到“胞饮”所经历的时间。

同“胞吐”的膜融合过程一样,“胞饮”的重酸化过程耗时也极短,为便于单独研究“胞吐”的过程,引入一种ATP酶抑制剂bafilomycin,使得囊泡在回收过程中不能被重酸化,即囊泡中环境始终呈碱性,使得pHluorin荧光消失这一环节不能发生,这样pHluorin所发出的荧光信号就可以作为胞吐过程的单纯量度。同时通过比较bafilomycin存在和bafilomycin不存在两种过程也可推测出胞饮的过程[3-6]

 

2 近年来突触前成像的研究进展

 

在过去的十年里,除了荧光素标记方法光素标记法电子显微镜技术被广泛应用于突触的生物学和生理学机能的研究。近几年发展起来的宽场显微技术(wide-field microscopy WFM)、多光子荧光成像显微技术(multi-photon microscopyMPM)、全内反射荧光显微术TIRFM 电镜X光断层摄影技术(electron microscope tomography EMT)、扫描近场光学显微术(SNOM)、原子力显微术(AFM等都对突触前膜的研究起到了很大的促进作用。

2.1 宽场显微技术(WFM

    该技术的成像原理是:宽场显微镜上的激光发射器以最大覆盖率向被观测样本表面发散光子,这些光子射到样本表面被散射,散射的光子被特定的信号接收装置接受,再通过计算机来将接收到的信号加以分析从而成像。该技术的优点是成本较低,缺点是它不能同时记录多种波长的光波信号且背景信号干扰较大(由很多聚焦平面发出的散射光和荧光所带来的干扰),这时就需要提高有效发散信号并将背景荧光降到最低以提高成像质量[17]

2.2 全内反射显微技术(TIRFM

    该技术是利用物理光学全内反射的原理来成像。使用可调整入射角度的激光发射器,配合高孔径值的物镜,使激光由物镜入射至样本时,在盖玻片与样本介质(主要为水溶液)的交界面,产生光学全内反射现象。此现象使光源不至于穿透交界面而激发整个样本,只有距盖玻片表面厚度不到   200 nm的范围区域为受激发范围,且受激强度随着与盖玻片表面的距离呈等比级数下降。该技术优点是,由于受激发的范围大大减少,可避免非焦面的样本产生发散荧光。缺点是检测范围小,只能检测到位于盖玻片与样本介质交界面处50-200nm范围内的光信号,这就极大的限制了该技术在生物研究方面的实用性。该技术现多应用于生物膜融合的研究[8-12]

2.3 多光子荧光成像显微技术(MPM

该技术是继激光扫描共聚焦显微技术(LSCM)基础上发展起来的。激光扫描共聚焦显微技术原理是使激光聚焦成线度接近单个分子的极小斑点,照射样品以产生荧光。焦点处的荧光信号可被接受,而焦点以外的荧光被空间滤波器过滤掉,这样就可获得被测细胞的一个层面的图像。通过连续改变激光的焦点,可以扫描一系列层面,从而获得整个细胞的三维图像。该技术最大的缺点是其聚焦激光的原理本身就很大程度的限制了成像区域的大小,即只能使焦点附近的很小范围成像,组织自身也需要有较大的荧光性才能被清晰成像,此外聚焦激光也会对被观测样本造成一定损伤。多光子荧光成像显微技术避免了上述缺点,不但可以将较低荧光性的样本成像出来,而且利用多光子技术,以近红外光激发样本产生荧光要比聚焦激光对细胞产生的损伤小得多。该技术目前主要应用于生物膜的研究。

2.4 电镜X光断层摄影技术(EMT

   该技术的原理是用电镜以不同的倾斜角拍摄样本,这样就可以得到样本各个角度的二维图像,再将这一系列二维图像通过计算机重组出生动的三维图像。该技术的优点是可以提供所观测样本的三维图像信息,而常规电子显微镜只能提供样本的二维信息,不能得知样本深层结构的信息。缺点是计算机将电镜得到的数据进行三维重组时,细胞中大量的微斑和囊泡等微小物质聚集在一起时会干扰成像画面的清晰度[7]。该技术目前多应用于研究化学突触的传递过程,还可应用于细胞骨架的研究。

2.5 扫描近场光学显微术(SNOM

该技术是基于非辐射场的探测与成像原理[13],把传统的光学镜头用一种光学探针代替,这种光学探针尖端的孔径远小于光波波长。用这种亚波长探针可探测到距离观测样本表面一个波长以内近场区域的纳米数量级光学信息。该技术的优点是它能突破常规光学显微镜的衍射极限,可在超高分辨率下进行纳米尺度的光学成像与分子水平的生物学研究。可用于研究细胞的有丝分裂、原位DNARNA的测序、基因识别、单个膜孔通道、膜受体成像等,在神经科学领域尤其是突触的研究有着广阔的前景。

2.6 原子力显微术(AFM

    该技术成像原理是通过探针与被测样品之间的微弱作用力(原子间作用例)以原子级分辨率测得样品表面电子分布,从而获得样品表面细微形貌的信息[14]。该技术可用于研究磷脂生物膜的重构,这将在突触前膜结构的研究和胞吐胞饮及囊泡回收的动态过程的研究中发挥巨大作用。

 

3 总结与展望

 

  FM1-43荧光染色技术和绿荧光蛋白突触前成像技术目前在突触前膜的研究中发挥着巨大作用。绿荧光蛋白(GFP)的到来大大扩充了细胞生物特性研究的方法,现已有实验表明应用GFP成像技术,细胞中某些活性蛋白的运动过程可被实时的检测出来,相信随着该技术的发展,GFP将会在细胞信号转导的研究中发挥更积极的作用。近来发展的超高分辨率光学技术(super-resolution optical techniques)也预示着在活体成像样本时的衍射干扰问题将有可能得到很好的解决[1617],这将为突触结构和功能的进一步研究打开一扇新窗。

 

 

1.          Timothy A Ryan:presynaptic imaging techniques . Neurobiology 200111: 544-549.

2.          Steven CFWilliams JH:’kiss and run’exocytosis at hippocampal synapses.Proc Natl Acad Sci USA 200097:12828-12833.

3.          Pyle JL Kavalali ET Piedras-Renteria ESTsien RW:Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses.Neuron 200028:221-231.

4.          Richards DAGUatimosim CBetz WJ: Two endocytic recycling routes selectively fill two vesicle pools in frog motor nerve terminals.Neuron 200027:551-559.

5.          Miesenbock GDe Angelis DARothman JE:Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensetive green fluoredcent proteins.Nature 1998394:803-808.

6.          Sankaranarayanan SRyan TA:Calclum accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses.Nat Neurosci 2001.

7.          Kristin Weidenbach: 3-D imaging technique casts light on structure of protein clumps on brain cells . 

8.          Johns LMLevitan ESShelden EAHolz RWAxelrod D: Restricton of secretory granule motion near the plasma membrane of chromaffin cells.J cell Biol 2001153:177-190.

9.          Steyer JAAlmers W:Tracking single secretory granules in live chromaffin cells by evanescent-field fluorescence microscopy.Biophy J 199976:2262-2271.

10.       Steyer JAHorstmann HAlmers W:Transportdocking and excytosis of single secretory granules in live choromainffin cells.Nature 1997338:474-478.

11.       Schmoranzer JGoulian MAxelrod DSimon SM:imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.J Cell Biol 2000149:23-32.

12.       Toomre DSteyer JAKeller PAlmers WSimons K:Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.J Cell boil 2000149:33-40.

13.       顾书龙:扫面近场光学显微术对近场光谱的研究  《巢湖学院学报》(自然科学版) 2002年第4卷第3期总第56期。

14.       刘冰:原子力显微镜及其在生物单分子研究中的应用   《分子生物物理学》研究生评述 2003

15.       Johns LMLevitan ESShelden EAHolz RWAxelrod D: Restricton of secretory granule motion near the plasma membrane of chromaffin cells.J cell Biol 2001153:177-190.

16.       Klar TAJakobs SDybs MEgner AHell SW :Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken bystimulated emission.Proc Natl Sci USA 200097:8206-8210.

17.       Gustafsson MGAgard DASedat JW:15M:3D widefield light microscopy with better than 100nm axial resolution. J Microsc 1999195:10-16.

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