2000年Gronthos^[1]采用酶联合消化法将从人第三磨牙牙髓中分离培养的单细胞悬液与羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）粉混合植入免疫缺陷小鼠皮下，形成牙髓牙本质复合体样结构。首次提出了牙髓干细胞（Dental pulp stem cells，DPSCs）的概念。DPSCs是存在于牙髓中具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞。

 

1 牙髓干细胞的提出

 

牙髓干细胞属于成体干细胞。Bohl^[2]等在不同的人工合成基质上培养牙髓细胞，发现牙髓细胞可以在体外形成牙髓样组织。Sloan^[3]等证明完整鼠牙横切片上的牙髓组织在某些生长因子的作用下可诱导牙本质分泌形成。Couble证实在β-磷酸甘油作用下体外培养的牙髓细胞可分化为成牙本质样细胞。Fitzgerald^[4]等认为未分化的牙髓细胞可能穿过牙髓间质，到达成牙本质细胞层下方分化成新的成牙本质样细胞。Gronthos^[1]等将从牙髓中分离培养的成牙本质前体细胞与骨髓基质细胞比较，提出牙髓干细胞这一概念，认为这种分离出的前体细胞的确有分化潜能，具有干细胞的特性。

 

2 人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

 

贺慧霞^[5]等采用胶原酶和Dispase酶联合消化法培养人牙髓干细胞，通过有限稀释法获得了人牙髓干细胞克隆，透射电镜下观察这种克隆形成细胞具有干细胞典型的超微结构特点，大多数细胞处于Go/G1期，为细胞周期的静止期，并具有牙源性未分化间充质细胞的表型特点。由此得出克隆化培养是人牙髓干细胞较为有效的分离纯化方法，该方法分离的人牙髓干细胞具有干细胞的结构、细胞周期及表型特点。

 

3 牙髓干细胞的性质

 

3. 1 高度的增殖能力

研究表明骨髓基质干细胞（bone marrow stromacells，BMSCs）可从骨髓抽取液中分离到，贴附于培养板上，通过适当的刺激开始增殖可形成克隆，所获得的每一个克隆均来源于一个干细胞。Gronthos^[1]借鉴BMSCs的研究方法，将牙髓细胞悬液和骨髓细胞悬液中克隆形成率作了对比，以对比研究DPSCs和BMSCs。结果发现在体外培养中DPSCs的增殖率比BMSCs更高，并且DPSCs在以后的传代中依然保持着较高的增殖能力。

3. 2 多向分化的潜能

DPSCs体外培养可分化为成牙本质样细胞和成纤维细胞，复合到支架材料上可形成牙本质—牙髓样组织。将DPSCs复合到羟基磷灰石—磷酸三钙（HA—TCP）支架上，后移植到免疫缺陷小鼠皮下，6周后，发现形成牙本质--牙髓样组织，其中成牙本质样细胞的突起深入到形成的牙本质基质中，牙髓样纤维组织中还出现了血管。DPSCs在L-维生素C和地塞米松诱导5—6周后可形成矿化结节，茜素红染色阳性。而且DPSCs移植物表达骨唾蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OC）以及DSPP。通过检测，还显示DPSCs形成的矿化基质呈球型钙化，方式类似原代牙本质。

体外诱导DPSCs可分化为脂肪细胞。Gronthos^[6]在培养基中加入0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、0.5（mu）mol/L氢化可的松、60（mu）mol/L消炎痛，对DPSCs进行成脂诱导。5周后，出现了油红O染色阳性的脂滴这是脂肪细胞所具有的特征，并且利用RT—PCR方法检测发现脂肪细胞所具有的两种特异性转录因子表达上调。

体外培养的DPSCs可以向神经样细胞方向分化。About检测到体外培养的牙髓细胞表达神经巢蛋白（nestin）。Nosrat研究发现牙髓细胞能产生多种神经营养因子，与三叉神经元复合培养可刺激轴突的生长。Gronthos^[6]等利用RT—PCR技术发现牙髓的起源细胞——DPSCs表达神经巢蛋白和胶质纤维酸蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP），这两种蛋白是神经前体细胞和神经胶质细胞的标志。

 

4 牙髓干细胞增殖分化的影响因素

 

4.1 碱性成纤维生长因子（bFGF）和转化生长因子（TGF-β）

在牙齿的发育、形成及牙髓的修复再生过程中，bFGF和TGF-β是最受关注的两类生长因子。bFGF有促进细胞有丝分裂、血管形成、神经营养及创伤愈合等多重生物学效应，特别是对中胚层和神经外胚层来源的细胞有丝裂原和形态发生作用。而TGF-β不仅直接参与了上皮和间充质之间的信号转导，而且在成牙本质细胞增生、迁移和分化中发挥重要作用。

贺慧霞^[7]等发现bFGF和TGF-β对体外培养的人牙髓干细胞增殖和分化具有重要作用。贺慧霞采用MTT法分别测定了bFGF和TGF-β作用不同浓度、不同时间单独或联合作用对人牙髓干细胞增殖能力的影响。通过碱性磷酸酶活性检测、细胞形态学观察及DSP、DMP—1免疫组化染色来检测这两种因子对人牙髓干细胞分化能力的影响。发现在0～40 ng/mL范围内，bFGF单独作用能显著促进人牙髓干细胞的增殖，具有浓度和时间依赖性，而TGF-β促增殖作用较弱；两者联合作用，促增殖作用无显著提高，而促分化作用显著增强，不仅细胞形态明显改变，而且碱性磷酸酶活性显著提高，DSP、DMP-1呈阳性表达，向成牙本质细胞样细胞分化。

4.2 骨形成蛋白

骨形成蛋白（BMP）在细胞生长、分化、凋亡和机体各种组织及器官发育过程中起重要调节作用。Nakashima^[8]发现培养的牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的过程中，BMP_2,4 mRNA随细胞外基质分泌的出现而增加，同时BMP_2,4反过来也增加细胞外基质的分泌，包括I、Ⅲ型胶原，骨钙素（OC），碱性磷酸酶（ALP）mRNA的表达及活性，促进其向成牙本质细胞的分化。Vainio^[9]等发现，在牙胚发育过程中，BMP₂表达一直持续到成牙本质细胞分化完成，而且成牙本质细胞分泌的细胞外基质也包括BMP₂，表明在成牙本质细胞分化和牙本质形成过程中，BMP₂起重要的调节作用。在体外培养的牙髓干细胞中加入BMP₂和肝素，能诱导成牙本质细胞功能和形态分化，并表达牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白，也表明BMP₂参与调控成牙本质细胞的分化。

4.3 β-磷酸甘油、抗坏血酸

    Liu J^[10]在体外培养的人牙髓干细胞中加入β—磷酸甘油（β--GP）、抗坏血酸，后经实时PCR检测结果显示I型胶原分泌增加，在矿化形成过程中骨唾液蛋白的分泌一直增加，而ALP在矿化明显时分泌减少。这些结果说明β--磷酸甘油、抗坏血酸可以诱导人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化并形成矿化结节。

4.4 Dentonin

    Dentonin是从细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）获得的只含23个氨基酸的小肽。Liu H^[11]在分离的人牙髓干细胞中加入Dentonin经检测发现P16表达下调同时伴有泛素蛋白连接酶E3A和人泛素相关蛋白SUMO-1表达上调。结果显示Dentonin可以促进DPSCs增值。 

4.5 生长与分化因子11 （GDF11）

Nakashima M^[12]在小鼠和犬身上发现GDF11可以促进牙髓干细胞牙本质唾液蛋白的分泌以及刺激牙髓创伤后的修复。2004 Nakashima M^[13]发明了经GDF11电转染的牙髓细胞的三维培养系统，而使DPSCs成活率及效能分别达到80%、70%,I、Ⅲ型胶原分泌增加3倍。实时PCR分析显示ALP、Dmp1、Dspp表达增加。

4.6 脂多糖（LPS）和肿瘤坏死因子（TNF）

Chang J^[14]发现LPS和TNF可以激活DPSCs中的I-kappa B激酶复合体，从而激活免疫转录因子NF-kappaB。另外，也一直诱导NF-kappaB因子IL-8的表达。

4.7 Notch配体Delta1

为探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化能力的影响，何飞^[15]等利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系研究发现：与正常牙髓干细胞相比，转导细胞各生长期出现时间明显提前，形成的钙化细胞结节数目显著增加，牙本质涎磷蛋白表达显著升高。说明Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力；Notch—Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。

 

5 牙髓干细胞增殖分化的调控机制

 

目前普遍认为干细胞增殖和分化的维持是由细胞间通过膜结合蛋白的相互作用调节的，Nortch信号就参与了该过程^[16]。对于DPSCs增殖分化的调节机制尚不清楚。但对小鼠切牙上皮干细胞的调控机制已有研究。Haradaa^[17]等对鼠切牙根尖末端培养中，发现Nortch信号和FGF10信号共同调节着上皮干细胞的分化和增殖，从而维持着小鼠切牙终生不断的萌出。FGF信号是一种间充质信号，可刺激上皮干细胞及其子代细胞的分裂。Tummers研究发现BMP4信号同FGF10一起参与了上皮干细胞的调节，并发现小鼠磨牙发育后期由于缺乏Nortch和FGF10的信号对上皮干细胞的调节，而停止了生长。牙齿的发生是在上皮和间充质的相互诱导作用下完成的，重组实验证实：间充质决定着牙齿的形状，调节牙上皮的持续生长。因而，调节上皮干细胞的信号分子可能也会作用于DPSCs。

 

6 牙髓干细胞的研究应用

 

牙齿的缺失与损坏是口腔常见疾病，目前治疗措施有充填材料、烤瓷牙、种植牙等，这些方法各有不足。为了使患者获得更好的生存质量，牙齿和牙髓组织的修复再生，是人类长久以来努力探索研究的领域。干细胞研究的深入和组织工程学的进展为我们提供了组织修复再生的新思路。

牙齿是典型的上皮一外胚间充质器官，由原口腔上皮和其下方的神经嵴来源的外胚间充质相互作用而形成。上皮和外胚间充质中的前体细胞群分化成为牙齿特有的成牙本质细胞和成釉细胞，开始形成牙齿硬组织是牙齿发育重要的里程碑，在出生后的机体中能否获得这些具有增殖分化能力的干细胞，对于牙齿的修复再生具有重要意义^[18，19]。牙髓干细胞是重要的种子细胞，而有关成釉细胞的研究也已展开，Harada^[20] 通过5-溴-2-脱氧尿嘧啶（5-Brdu）和Dil标记显示大鼠颈环上皮中有干细胞存在，能够增殖分化为成釉细胞。Harada^[21，22]又先后报道了重组的fg10避免颈环凋亡，在发育的切牙牙胚上皮中保持干细胞的存在。Young等^[23]首次利用动物牙胚细胞培育出既包含牙本质，又包含牙釉质的复杂牙冠。利用成体干细胞—牙髓干细胞等牙源性干细胞进行体内和体外的组织重建，将促进牙髓组织再生及修复性牙本质形成的因子导入的基因治疗，将对保髓治疗，诱导根管内牙髓再生有重要意义。但目前的技术问题在于干细胞数量少，分离纯化难，且干细胞随年龄增加而减少，扩增难度大，周期长。随着这些问题的深入研究和解决，相信牙髓干细胞将具有极其广阔的应用前景，它在研究与应用方面上的成功，将在口腔医学史上产生深刻的影响。

 

参 考 文 献

 

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3.          Sloan AJ，Smith AJ．Arch Oral Biol，1999，44（2）：149—156

4.          Fitzgerald M，Chiego DJ，Heys DR．Arch O Biol，1990，35（9）：707～715

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