王苏春
【摘 要】 基因芯片技术的诞生是基于人类基因组计划的成果，它以一种全面、综合、系统的思维方式来研究生命现象。同时，它还是疾病诊断和治疗的重大方法学突破，也是新药开发筛选的新方法。
【关键词】 基因芯片；基因表达；基因诊断
谈到芯片，自然会想到计算机的日新月异、软件和硬件的协调发展、信息社会的灵活运转，这都是建立在芯片的高集成度基础上。1953年，Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，从此开创了分子生物学研究的新时代。采用分子生物学技术从分子水平上研究生物的生长、生育和分化等生命现象，揭示了复杂的生命现象是大量基因相互作用的结果。随着人类基因组计划（human genome project，HGP）的顺利完成以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定，基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。基因芯片技术的研制及其迅猛发展，使得研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能成为可能。近年来，基因芯片技术在生命科学领域的研究已取得了一些开拓性进展，受到科学界的广泛关注。
1 基因芯片的概念和发展概况
基因芯片（gene chip）又称DNA芯片、DNA微阵列芯片或寡聚核苷酸芯片，是生物芯片的一种。基因芯片采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于玻璃或尼龙基底等支持物上，形成二维阵列，与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，从而检测特定基因。
20多年前，Southern 发现经过标记的核酸分子可用于检测结合在固相支持物上的核酸，首次引入了克隆与杂交信号间一一对应的关系。20世纪80年代中期，有人将八聚寡核苷酸探针固定在尼龙膜上进行杂交测序。随着无孔固相支持物的使用和高密度寡核苷酸的合成这两项关键技术的开展，出现了真正意义上的基因芯片。1988年，Bains等将短的DNA片段固定至支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。20世纪90年代，美国Affy-metrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。当今，随着生命科学与众多相关学科（如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等）的迅猛发展，为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。微型阵列技术由于采取玻璃片和硅片等载体，从而使用芯片能达到真正的平行实验、微型化、多路复用和自动化。这些特点，使其能够进行早期技术所不能完成的一些应用。
基因芯片技术类型：（1）按用途分类：根据基因芯片的用途不同，可分为DNA芯片和表达芯片两类。（2）按探针分类：根据点样上的探针不同，可将基因芯片分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片及DNA芯片。（3）按应用领域分类：根据不同的应用领域而制备的专用芯片，可分为表达分析芯片、肿瘤研究芯片、药理毒理芯片、病毒检测芯片等。基因芯片的类型根据分类方法不同可分为不同类型，还有很多其它的分类方法。
2 基因芯片的制备和基本操作
2.1 基因芯片的制备
基因芯片的制作过程包括以下几个步骤：①探针的设计与合成；②芯片支撑物的处理；③DNA阵列点印；④芯片后处理，包括重新水合化及干燥、UV-交联、封闭及变性；⑤ 芯片质量检测。几个步骤中最关键的是DNA微阵列的点印，目前分为两种主要类型：原位合成（in situ syn-thesis）与合成后以微量点样技术点样。原位合成微型阵列采用阶梯式的方法在原位合成核酸，每一轮加一个核苷至不断增长的链上，直至达到所需的长度。而微量点样技术，则是将少量经PCR扩增和纯化后的分子（如cDNA），用不同方法转移至芯片的指定位置上。另外，也出现了一些新方法，如Kimu-ra等。用未经修饰的寡核苷酸探针与经碳二亚胺处理的玻璃表面，在紫外线的作用下结合，发现紫外线能使信号密度增加7倍，但并未改变信号分辨能力，单核苷酸多态性（SNPs）的配对/错配信号比也有提高。
2.2 基因芯片的基本操作
2.2.1 待测核酸的制备 待测核酸一般为从所研究样本中提取的DNA或RNA。由于检测灵敏度所限，需要对样品进行PCR扩增，并对扩增产物进行荧光标记，方法包括末端标记和随机插入，前者是在PCR引物上标记有荧光探针；后者将核苷酸标记荧光，在PCR过程中，掺人适量荧光标记的核苷酸。
2.2.2 杂交反应 基因芯片杂交反应过程十分简便。但杂交条件的选择需考虑多方面的因素，如杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。由于基因芯片影响因素很多，所以要合理设置异种核酸平行实验、核酸质量检测对照、封闭对照、归整化对照，以保证结果的准确性和重复性。
2.2.3 成像分析 常用的芯片成像分析系统有激光共聚焦扫描仪和电荷耦合（CCD）扫描仪。前者的激光光源可产生激发不同荧光染料的光。当探针与待测核酸完全正常配对时的荧光信号强度是具有单个或2个错配碱基探针的5～35倍，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。CCD扫描仪将图像分成若干小块，测定每个小块中的平均荧光强度，进而求阵列中每个点的相对荧光强度，通过计算机处理获得结果。还有人自己设计或利用已有的共聚焦显微镜、荧光显微镜等改装为芯片扫描装置。Cheung等自行设计构建了激光扫描仪，可同时测定双色荧光染料标记的生物芯片。
3 基因芯片技术对生命科学发展的影响
基因芯片技术以一种全新、系统的科研思维方式来研究生物体，使揭示早期发育、分化、衰老、癌变等一系列复杂生命现象成为可能。基因芯片在生命科学研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等。基因芯片技术已成为生命科学研究的有力工具，极大地推动了生命科学的发 展[1] 。
3.1 基因表达分析
随着人类基因组计划的实施，越来越多能够表达的人基因序列以及引发疾病和能预测疾病的各种突变正在被人们逐渐认识。多种疾病如肿瘤的发生发展都涉及多个基因的表达改变。利用基因芯片，可高敏感地定量、定性检测基因表达水平，且能同时研究同一组织中成千上万个基因的表达情况，为疾病的诊断和治疗提供了有益的信息。Seholl等发现，一个来自原始葡萄簇状的横纹肌肉瘤的新细胞株在培养一段时间后，出现转移表型，运用DNA微集阵列分析前后的基因表达差别，发现编码金属蛋白酶组织抑制因子的基因下调，编码基质金属蛋白酶的基因上调；同时，肿瘤坏死因子家族的几个死亡受体下调，使得出现转移表型的细胞对相应的凋亡刺激的反应发生了改变，从而能够在基因组水平上解释肿瘤细胞的形成及转移特性的分子机制[2]。Oshima等从新发急性髓细胞白血病和继发于骨髓异常增生综合症的急性髓细胞白血病各10例患者中纯化出AC133阳性造血干细胞，运用DNA微集阵列分析检测，测定了大于12000个基因表达谱，确立了两者特有的分子标记物，从而有助于两者鉴别诊断及进行临床化疗效果的预测[3]。Kitahara等使用含有9126个靶标DNA的cDNA芯片检查了与结直肠癌发生相关的基因表达模式变化，成功辨别了正常结肠组织和肿瘤转移性结肠组织的不同表达模式，目的在于说明自正常结肠上皮细胞到腺癌转变过程中的相关基因[4]。
3.2 基因诊断
将基因芯片上的DNA阵列分别与来自正常人和患者基因组DNA进行杂交，对杂交后的两种图谱进行比较分析就可以找出引发病变的DNA信号。目前，采用基因芯片技术可以对肿瘤、遗传性疾病等作出精确诊断。
DNA芯片在癌症研究中的应用主要有两方面：一为确定病变组织基因表达的特殊序列模式，探测患病细胞相对正常细胞基因表达水平的差别；另一为检出与人类疾病有关或癌症发展过程中受到影响的基因突变点[5] 。DNA芯片已用于检测出乳腺癌中的BRCA1、BRCA2突变密码和卵巢癌的TP53突变[6]，测定了人类食管癌基因谱[7]，进行了结直肠癌的分子识别等[8]。Nishizuka等通过才cDNA微集阵列，Affymetrix寡核苷酸芯片及反相蛋白微集阵列，测定出结肠癌的另一种分子标记物-绒毛蛋白，为其区别于卵巢癌的诊断和治疗用药提供了新的依据[9]。Aderson等用5-脂氧合酶抑制剂MK886处理人类胰腺癌细胞系PANC一124h后，采用基因芯片对其癌基因、抑癌基因、细胞周期相关分子等表达改变进行了检测，结果表明，基因芯片可用来识别癌症治疗的潜在分子靶标[10]。
基因芯片技术在同一块芯片上能同时对人体50多种组织器官的600多种细胞不同时空基因表达的庞大信息进行平行和整体分析，可用于大规模筛查检测由基因突变所引起的遗传性疾病。Brown等用脆性x综合征[Fra（X）]患者的细胞做探针制成基因芯片，然后从大鼠脑中取出432种与FMR蛋白相关的mRNA，使其与基因芯片杂交，结果发现有251种mRNA存在异常多核糖体的改变，从而得出结论，与FMR蛋白相关的mRNA的异常翻译导致了Fra（X）的发生[11]。
3.3 DNA序列分析
用于测序是基因芯片技术最早的用途。利用基因芯片可对数千个碱基长的DNA进行序列测定，大大提高了DNA测序的速度。基因家族各成员间的比较序列分析，对于确定基因的结构、功能、调节和进化等都是很有价值的。芯片技术能辨别单核苷酸多态性（SNPs），当基因组序列中的单个核苷酸发生突变，就会引起基因组DNA序列变异[12]。有学者通过运用DNA微集阵列分析研究与早期心血管疾病相关的候选基因—TSP基因家庭，结果发现TSP-1和TSP-4基因错义变异与早期冠状动脉疾病相关，它们在血液凝固和动脉修复中起重要作用，而TSP-2基因非编码区的突变却在心脏病的发生过程有一定的保护作用[13]。
在卵巢癌发展过程中，基因TP53起到临界基因作用，Haviv 等分别使用传统的DNA序列分析法和一种TP53寡核苷酸微阵芯片对108例卵巢肿瘤进行分析，根据TP53突变共计识别77例卵巢癌，使用微阵列分析识别71例，而传统的凝胶电泳DNA序列分析识别63例，从整体来看，相对于传统的DNA序列分析而言，寡核苷酸微集阵列显示出更高的精确度和灵敏度[14]。
3.4 药学研究
以基因芯片技术为基础的另一很有应用价值的研究方向是用基因芯片技术所具有的高集成度与组合化学相结合，为新药研究的初筛提供超高通量筛选。目前有学者分离中药材，如贝母、金银花等的特异核苷酸序列，以此作为探针制备成基因芯片，可以对它们的真伪和有效成分进行快速鉴定和分析。
基因芯片也可用于指导临床用药。如Incyte公司用基因芯片技术结合Zooseq数据库中存有的小鼠、大鼠和猴等的基因组序列，能够在研究不同生物基因表达差异的同时，对新药的药理学和毒理学进行研究，可为临床用药提供线索。Incyte公司还推出了一种大鼠毒理学基因芯片，使研究者能够定量研究新药对大鼠基因表达的影响。在临床上，也可应用基因芯片技术观察不同药物对疾病的治疗反应和代谢调制作用，从而选择合适的治疗方 案[1]。
有学者提出利用DNA芯片测定癌细胞中唯一或过表达的mRNA序列，然后人工合成能与之互补结合的寡核苷酸，经修饰后作为载体与药物及催化剂结合，在进入细胞后与目标mRNA互补结合，前体药物与催化剂接触发生化学反应而杀死癌细胞，并进行了体外实验，取得了一定进展[16]。
基因芯片技术用于肝细胞癌表达谱研究可发现肝癌的耐药相关基因[17]。
3.5 营养学研究
营养学作为生命科学的重要分支之一，也受益于生物技术的发展。有许多高新生物学技术如RT-PCR，酵母双杂交系统都运用于营养学的科学研究，DNA芯片技术也不例外，为深入研究营养素生理功能及其分子机制提供了很好的方法。角化细胞生长因子（FGF-7）是成纤维细胞生长因子家族中的一员，曾被认为是细胞生长分化的旁分泌性调节因子，而维生素D能抑制某些生长因子[18]。Lyakhovich等应用DNA芯片检测了1,25-二羟维生素D3处理过的乳腺癌细胞的FGF-7表达发现，无论在mRNA水平还是在蛋白水平都明显增加，从而首次揭示了维生素D可能通过调节FGF-7而调节细胞的生长分化[19]。
3.6 其他方面
目前，基因芯片技术在法医鉴定方面也得到应用。针对人类基因组小卫星VNTR位点靶序列做RFIP分析，为第一代法医DNA分型技术，以基因组内STR位点多态性位点为靶序列做PCR扩增，利用电泳分离，分析STR位点多态性，是第二代法医DNA分型技术。SNPs位点在基因组中广泛分布，DNA芯片技术是解决同步测定大量SNPs基因型的有效途径，检测的越多，越能反映个体的差异，以此为基础将建立起第三代法医DNA分型技术。这一技术原则上可揭示人的外貌特征和体型，比一般意义的DNA指纹谱又进了一步[20]。基因芯片能大规模扫描多种已知和未知基因的表达，从而一次可对数万个基因进行检测筛选。因此，它具有强大的基因检测功能，利用该技术，目前已成功筛选出了数百个新的侯选肿瘤基因[21]。基因芯片技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测动物组织中钩端螺旋体的有效方法，在钩端螺旋体病的早期诊断、流行病学调查中，具有重要的实用价值[22]。
4 结束语
短短几年，以Affymetrix公司为代表的DNA芯片技术发展迅速，将生物科学与计算机科学、数学、化学、物理等各门学科融合在一起，开创了广阔的应用领域。相继在药物检测、法医学检测、临床疾病的诊断、化妆品的研究、食物检测及在航空航天领域中显示其重要作用。有人预测下一个世纪将是芯片技术发展的时代。
因为时间短，DNA芯片技术还存在不足和缺撼。该技术需要昂贵设备，例如制造过程中的各种仪器。现代化的实验平台及激光共聚焦显微镜等，并且制造光刻掩膜需极高费用。DNA芯片上原位合成探针难免有错误的核苷酸掺人及混入杂质，使整个杂交背景增高。降低特异性，种种因素影响了DNA芯片投放市场及进入商业化产品的速度。目前国外正在致力于这些问题的解决与研究，国内也有研究者正在积极地开展该项研究工作。我们有理由相信，随着该技术的不断完善与发展，在将来，基因芯片会作为一种简便快捷的技术，为我们的研究工作与临床检测带来极大的便利。
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