牛 舜
【摘 要】 汉坦病毒的致病作用以引起血小板减少和血管通透性增加为主要特征，在人类可导致出血热肾功能综合征（HFRS）和肺综合征出血热（HPS）。病毒感染细胞的首要环节是和细胞膜上的特异性病毒受体结合。本文对近年来汉坦病毒的受体以及作用位点的研究成果作一综述，并对汉坦病毒的内在化过程和致病机制进行了简单的论述，以供广大研究者参考。
【关键词】 汉坦病毒；受体；整合素；致病机制
0 引言
汉坦病毒可引起两种以血小板减少和血管通透性增加为主要特征的人兽共患疾病[1]：出血热肾功能综合征（HFRS）和肺综合征出血热（HPS），在我国以HFRS为主。病毒感染细胞首先要与细胞表面的受体结合，受体在病毒内在化过程及致病机制方面有着重要的作用。因此对汉坦病毒受体及其作用位点的研究，将有助于我们认识其致病机制，以达到更好的预防及治疗效果。关于汉坦病毒的受体，IN.Gavrilovskaya 等人于1998年提出β3整合素是致病性汉坦病毒受体，而β1整合素是非致病性汉坦病毒受体[2]，并于2005年提出位于β3整合素上的plexin-semaphorin–integrin（PSI）结构域是汉坦病毒与整合素相互作用的位点[3]。其他学者关于汉坦病毒内在化过程的研究也为我们进一步揭示汉坦病毒的致病机制提供了宝贵线索。
1 汉坦病毒受体研究现状
汉坦病毒是单负链RNA病毒，基因组由三个片段构成：编码RNA聚合酶的L（large）片段，编码囊膜糖蛋白G1、G2的M（middle）片断和编码核蛋白的S（small）片断[4]。汉坦病毒通过出芽方式增殖，不对宿主细胞产生明显的杀伤作用。
病毒受体参与病毒识别和结合等过程，并促进病毒内在化和感染细胞，是决定病毒的宿主特异性和组织、细胞亲嗜性的主要因素之一[5]。病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节，而病毒受体本身是具有一定生理功能的细胞膜组分。病毒与其结合必将引起受体生理功能的异常，从而影响受体下游的信号通路，使宿主显示出一定的的致病表型。因而，研究病毒受体对于我们认识病毒感染过程以及致病机制将有重要作用。目前文献报道的汉坦病毒受体有两种：位于细胞膜表面的β3整合素[2，3]和一种30kDa蛋白[6]。但对于这两种膜受体的阻断都不能完全抑制汉坦病毒的感染[2，6]，预示着除此之外汉坦病毒很可能还存在其他受体或整合素的协同受体[2，6，7，8]。
近来，ER.Mackow 等人提出汉坦病毒与 αvβ3整合素的作用位点是位于非活性形式的αvβ3整合素顶端的PSI结构域[3]，使我们在进一步揭示汉坦病毒致病机制的路上又前进了一步。
2 整合素受体
2.1 整合素的结构及生理功能
整合素是细胞膜表面一类重要的膜分子，由α和β亚单位组成，目前在哺乳动物中已发现18种α亚单位和8种β亚单位，共组成24种异源二聚体[9, 10, 11]。α和β亚单位通过NH2-末端相互作 用[12]，并形成球状的头部；其余的区域则形成棒状尾巴的跨膜区[13]。整合素具有介导细胞间黏附，免疫细胞招募、外渗，血小板聚集，Ca2+通道激活以及内皮细胞在细胞外基质蛋白上移行的能力[14, 15]。整合素胞内区与细胞骨架相连，胞外区与其相应内源性配体结合后通过相应的胞内信号转导调节转录应答并调控其他整合素的功能[16-19, 20]。
β3亚基组成的成员有αvβ3和αⅡbβ3两种，都是内皮细胞和血小板表面的丰富受体。αvβ3整合素还位于巨噬细胞表面[21]，在维持血管内皮完整性中具有重要作用；而αⅡbβ3整合素仅位于血小板表面，在血栓形成过程中调节血小板的激 活[14，15]。另外，位于骨骼肌的αvβ3和α5β1整合素能通过胞内L-型Ca2+通道分别调控小动脉的舒张和收缩[20]。IN.Gavrilovskaya 等人的研究表明β3整合素是致病性汉坦病毒受体，β1整合素是非致病性汉坦病毒受体[2]，它们可以通过不同的β亚单位引起相反的胞内Ca2+流，为汉坦病毒的致病机理提供了进一步的理论基础。
2.2 β3和β1整合素分别是致病性与非致病性汉坦病毒受体
2.2.1 整合素配体阻断实验 IN.Gavrilovskaya 等人用纤维蛋白原、肝素、波连蛋白、粘连蛋白、层粘连蛋白、植物凝集素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素等配体预处理Vero E6细胞[2，22]，再用汉坦病毒感染细胞。结果用波连蛋白预处理细胞显著的阻断了NY-1和SNV的感染，并能减少70%SEO和PUU的感染，以及60%HTN的感染，但并不能阻断PHV的感染[2]；粘连蛋白能减少80%PHV的感染，以及约20%HTN和10%SEO的感染。而其他配体对NY-1、SNV、HTN、SEO、PUU、或PHV的感染没有影响。
最近，ER.Mackow 等人通过监视在蛋白A/G树脂上固化的汉坦病毒与αvβ3整合素结合的情况，同样得出了以上结论[3]。
这些结果表明：致病性汉坦病毒与非致病性汉坦病毒可能通过不同的整合素介导细胞感染。在细胞膜上波连蛋白和粘连蛋白分别是β3整合素和β1整合素的生理配体，说明β3整合素和β1整合素很可能分别是致病性与非致病性汉坦病毒的膜受 体[2, 22]。
2.2.2 整合素抗体阻断实验 IN.Gavrilovskaya等人用β3整合素的单克隆抗体及多克隆抗体预处理Vero E6及HUVECs细胞，再用汉坦病毒感染，结果预处理后能特异地抑制60%-70% NY-1和SNV的感染。αvβ3的单抗能抑制70% NY-1的感染，70%-80% HTN、SEO和PUU的感染，而αv、β3或αvβ3的单抗对SNV和PHV的感染没有影响。仅β1或α5的单抗能抑制PHV的感染（80%），但其不能抑制HTN、SEO和PUU的感染[2, 22]。
以上结果进一步表明：β3和β1整合素分别介导致病性与非致病性汉坦病毒感染细胞。
2.2.3 重组整合素实验 由于病毒感染细胞必须依靠细胞表面的特异病毒受体[5]，所以对于缺乏β3整合素的CHO细胞来说，汉坦病毒并不具有感染性。IN.Gavrilovskaya等人用重组β3整合素转染CHO细胞（CHO-VNRC、CHO-A5），测定病毒感染水平。结果显示：表达人重组αⅡbβ3整合素的CHO细胞可感染SNV和NY-1，但并不会感染PHV[2]。
以上各实验证明了β3和β1整合素分别是致病性与非致病性汉坦病毒的膜受体，提示汉坦病毒与不同的β亚单位结合会通过不同的信号转导途径引起不同的生理及病理反应[23]。
又由于各种整合素阻断实验均不能完全阻断汉坦病毒的感染[2，22]，预示着除了整合素之外，汉坦病毒还存在着其他膜受体[2，6，22]。
2.3 汉坦病毒与整合素作用位点的确定
最近，对于与汉坦病毒与整合素相互识别作用位点的研究取得了巨大进展[3]。
2.3.1 汉坦病毒识别受体是RGD非依赖性的 整合素与生理性配体的相互识别结合往往是RGD三肽依赖性的。IN.Gavrilovskaya 等人的研究结果表明RGD或RGE肽段并不能阻断NY-1、SNV、HTN、SEO和PUU的感染，波连蛋白对汉坦病毒的阻断更像是是通过空间位阻作用实现的。这些结果表明：致病性汉坦病毒识别β3整合素是RGD非依赖性的[2，22]。
2.3.2 αvβ3整合素晶体结构
最近对αvβ3整合素的晶体及EM结构分析表明：αvβ3整合素有活性伸展形式和非活性卷曲形式两种构象，并受Mn2+及Ca2+的动态调节[9-11]。被Mn2+激活的αvβ3整合素可与配体结合，结合位点位于αvβ3整合素异二聚体顶端伸出的球形头 部[9]。相反，Ca2+参与非活性构象的αvβ3整合素的形成，非活性的αvβ3整合素异二聚体几乎卷曲了一半，使得位于细胞表面的配体结合区域隐蔽起 来[9]。
2.3.3 致病性汉坦病毒能识别并结合β3整合素的N-末端结构域
实验表明：人β3亚单位1-136残基有结合NY-1或HTNV的能力。另外，用人β3多肽预处理NY-1或HTNV可阻断病毒对Vero E6细胞的感染[3]。这些结果表明：人β3整合素的N-末端结构域能结合汉坦病毒并可竞争性抑制NY-1V与HTNV的感染。
2.3.4 PSI结构域是致病性汉坦病毒与β3整合素相互识别的位点
重组人β3整合素亚单位可介导汉坦病毒感染CHO细胞，而且与αv的来源无关[2，24]。ER.Mackow 等人用质粒表达的嵌合人/鼠β3亚单位与人αv表达质粒共转染入CHO细胞，结果包含有人β31-43残基的嵌合体可介导NY-1与HTNV而不是PHV感染细胞[3]。这些结果表明整合素与汉坦病毒结合的位点位于β3整合素N-末端的PSI同源序列。
实验中用β3 亚单位的突变株V22M、SQ32/33PL和N39D转染CHO细胞，结果鼠 β31-53多肽中N39D的改变抑制了75%NY-1的感染，而其他突变并无明显的影响[3]。这些结果提示在人 β3PSI结构域中的天冬氨酸-39对于致病性汉坦病毒的感染是必需的。
由于αvβ3整合素具有活性与非活性的两种构象，为确定汉坦病毒是否选择性地与非活性构象的整合素相互作用，ER.Mackow 等人在CHO细胞表达了以上两种构象的重组αvβ3整合素。结果表达活性伸展构象αvβ3整合素的细胞不能感染汉坦病毒；相反，表达非活性卷曲构象αvβ3整合素的质粒可增强病毒的感染[3]。以上结果表明：致病性汉坦病毒与αvβ3整合素的作用位点是非活性卷曲构象的β3整合素顶端的PSI结构域[11]。
3 病毒内在化过程
病毒与膜受体结合后，需要通过一定的途径内在化。目前认为受体介导的病毒内在化有两种途径：笼形蛋白介导的内吞作用和细胞膜穴样内陷作用。而Mirim Jin 等人的研究表明：汉坦病毒内在化是依靠笼形蛋白介导的内吞作用[8]。
3.1 IAP不参与汉坦病毒内在化过程
β3整合素常与细胞表面一种50kDa的凝血栓蛋白受体IAP结合[28]。研究表明：IAP特异性单克隆抗体预处理IAP并不能抑制汉坦病毒感染[22]。因此，IAP不参与汉坦病毒的内在化过程。
3.2 笼形蛋白介导汉坦病毒内在化过程
为了验证汉坦病毒的内在化是否依靠笼形蛋白，Mirim Jin 等用氯丙嗪和蔗糖阻断笼形蛋白的内吞作用[8]，对照组是用FITC标记（绿色荧光）的转铁蛋白，实验组是汉坦病毒。结果FITC标记的转铁蛋白内在化被抑制；同样，汉坦病毒的感染也被减弱。为了进一步证明，Mirim Jin 等用FITC标记的高滴度汉坦病毒感染Vero E6细胞，并在培养基内加入Texas红标记（红色荧光）的转铁蛋白。结果，FITC标记的汉坦病毒颗粒和Texas红标记的转铁蛋白颗粒共同出现在细胞质中。用共聚焦显微镜发现汉坦病毒颗粒和转铁蛋白颗粒位于胞内同一区域，说明他们共存于胞内内吞作用的膜室内；而细胞膜穴样内陷作用的标记物霍乱毒素B亚单位则不能同汉坦病毒颗粒共聚焦。以上实验说明笼形蛋白介导汉坦病毒内在化过程。
Mirim Jin 等还用共聚焦的方法证明了汉坦病毒进入细胞后通过膜融合的方式进入内体，随后进入溶酶体，而新复制的病毒颗粒也同样进入溶酶 体[8]。由此揭示了汉坦病毒颗粒在胞内的增殖循环过程。
但由于抑制笼形蛋白的内吞作用并不能完全阻断汉坦病毒的内在化，所以，汉坦病毒很可能还存在其他的内在化通路。
4 汉坦病毒致病机制
4.1 致病性与非致病性汉坦病毒感染细胞方式及引起细胞应答不同
内皮细胞是人体脉管系统的首要屏障，内皮细胞功能的异常可以引起血管通透性改变及出血症状[29]，同时血管内皮可以通过诱导细胞因子、化学因子以及细胞受体的招募引起机体免疫应 答[30]。内皮细胞是汉坦病毒最主要的的靶细胞，研究内皮细胞对于致病性与非致病性汉坦病毒感染应答的差异，将有助于我们了解汉坦病毒的致病机制。
ER.Mackow 等人用Affymetrix DNA序列分析实验在mRNA水平检测汉坦病毒感染内皮细胞引起细胞mRNA水平的差异[23]。有趣的是，表达上调的基因数量大约是表达下调基因数量的5倍，这与同是单负链RNA病毒的流感病毒相反。表明即使是复制方式相同的病毒也有可能通过不同的方式调节细胞转录。
Affymetrix DNA 实验的结果还揭示了一个重要的现象：在感染后一天，非致病性汉坦病毒PHV引起了67个基因的表达异常，而与此同时，HPS或HFRS相关的致病性汉坦病毒仅仅引起了最多3个基因的表达异常[23]。
MxA有明确的抗病毒作用，PHV感染后一天，MxA的表达增高了161倍；而NY-1与HTNV的感染分别只诱导了3.7倍和大约2倍MxA表达的增 高[23，31]。原因是在汉坦病毒感染的早期，非致病性汉坦病毒PHV可诱导24种特异性IFN高表达，从而限制非致病性汉坦病毒的复制，使PHV表现为非致病性。因此，感染后快速的细胞应答有助于病毒的清除以及病毒复制的抑制。
以上实验表明，致病性汉坦病毒对细胞因子、化学因子以及细胞受体诱导的延迟正是其具有致病性的关键所在。
4.2 β3整合素在汉坦病毒致病中的作用
4.2.1 VEGFR-2与β3整合素相互作用是汉坦病毒致病机制的基础
VEGFR-2是内皮细胞上的一种受体酪氨酸激酶，起到介导内皮细胞迁移和改变内皮细胞通透性的作用[32]，不表达β3整合素的内皮细胞移行功能障碍[33]。研究表明：不表达β3整合素的细胞具有高水平的VEGFR-2，将β3整合素转染入不表达β3整合素的细胞中可减少VEGFR-2的表达水平，说明αvβ3整合素可调控VEGFR-2的转录，β1整合素则无此作用[33]。
因此致病性汉坦病毒选择性阻断内皮细胞的作用很可能是通过使αvβ3整合素调控VEGFR-2应答功能的失调实现的。
4.2.2 汉坦病毒感染与β3整合素受体数量无关
IN.Gavrilovskaya 等人用流式细胞计数法检测汉坦病毒感染细胞后可否引起膜表面整合素受体数量的相对下调，结果αvβ3整合素受体的相对数量并没有因为汉坦病毒的结合而下调。说明汉坦病毒的感染与αvβ3整合素的功能有关而与受体数量水平无关[27]。
5 协同受体
整合素的抗体并不能完全抑制汉坦病毒的感染，而用某些α亚单位特异性抗体阻断α亚单位，也能部分抑制汉坦病毒的感染[2]，说明细胞膜上还有其他汉坦病毒受体或协同受体的存在。
Tae-Yeon Kim 等利用 Virus overlay protein-binding （VOPB）实验证明细胞膜上的一种30kDa蛋白是汉坦病毒受体[6]。并用未标记的汉坦病毒和脊髓灰质炎病毒与标记的汉坦病毒竞争与30kDa蛋白的结合，结果未标记的汉坦病毒可与标记的汉坦病毒竞争与30kDa蛋白的结合，而脊髓灰质炎病毒不能。说明汉坦病毒与30kDa蛋白的结合是特异的[6]。
M.Ogino 等用DBA、SBA处理Vero E6细胞[7]，结果在感染中期处理比在感染早、后期处理能引起更明显的感染增强作用。说明GalNAc特异的植物凝集素能增强汉坦病毒的感染，并且此增强作用是在病毒感染的较早阶段（病毒颗粒吸附及内在化）起作用的。在植物凝集素介导的汉坦病毒感染增强作用中，DBA、SBA通过其碳水化合物结合位点起到了在病毒颗粒和细胞分子之间交叉结合的作用。用biotinylated-lectin进行植物凝集素印渍实验，证明了植物凝集素是通过与汉坦病毒的囊膜糖蛋白G1或G2结合而影响汉坦病毒感染的。
6 研究展望
为什么有些汉坦病毒有致病性而有些没有，为什么同样是致病性汉坦病毒，有的可引起HPS，而有的可引起HFRS？
ER.Mackow 等人用基因芯片技术，分析致病性汉坦病毒与非致病性汉坦病毒感染细胞后，引起细胞在mRNA水平的表达差异[23]。结果在病毒感染早期，非致病性汉坦病毒PHV引起了67个基因的表达异常；与此同时，HPS或HFRS相关的致病性汉坦病毒仅仅引起了最多3个基因的表达异常。而病毒感染晚期致病性汉坦病毒与非致病性汉坦病毒引起的基因表达异常趋于一致（117个基因上调，25个基因下调）。
仅HTNV可引起IFN-α、IL-8、IL-6、GRO-β、GRO-γ、GM-CSF、G-CSF、CKA-3、IL-7R、Cox-2、ICAM、补体片段1抑制因子、Bcl-6等大于3倍的高表达；HTNV和PHV还可同样引起另外5种化学因子高表达，而NY-1V只影响了3种。
对于汉坦病毒感染在mRNA水平上差异的研究，将有助于我们进一步研究汉坦病毒的致病机制。
RNA干涉（RNA interference ，RNAi）是近几年发现和发展起来的一门转录水平上的基因阻断技术[34]。通过此技术可使感兴趣的靶基因表达沉默，具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地阻抑特定基因的表达[35]。因此在研究病毒作用机制方面具有很大的前景。同时也可能成为基因治疗和基因功能分析的一个革命性工具。目前，还没有关于将此技术应用于汉坦病毒致病机制及治疗方面研究的报道，我们期待着将这一先进而有效的技术应用于汉坦病毒的研究，以取得更大的进展。
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